从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一系列亚克隆。 从含抗坏血酸培养基生长的成骨细胞中选择高或低成骨细胞分化、矿化的亚克隆。 MC3T3亚克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亚克隆14（ATCC CRL-2594）在抗坏血酸和3到4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的成骨细胞分化。 它们10天后形成一个矿化良好的细胞外基质（ECM）。

MC3T3亚克隆24（ATCC CRL-2595）和MC3T3亚克隆30（ATCC CRL-2596）在抗坏血酸中生长表现出很差的成骨细胞分化。 不形成ECM， 可以作为亚克隆4和14的阴性对照。 矿化的亚克隆选择的表达作为成骨细胞标记的mRNA，及唾液酸糖蛋白（BSP），骨钙素（OCN），和甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关蛋白受体的mRNA。 高或者低的分化潜能的亚克隆在培养中生产出相似数量的胶原质，表达可比较的基本水平的mRNA编码Osf2/Cbfa1，一种成骨细胞相关转录因子。

本期为大家总结了，在诱导MC3T3-E1细胞过程中的注意事项和具体操作步骤。

细胞的培养

培养条件

培养基：MEM α +10%胎牛血清+1%双抗（注意：MEM α 不含VC组分） 

推荐传代比例：1：4-1：8

换液频率：  2-3次/周 2-3次/周

培养条件： 5% CO₂，37°C

2 成骨诱导分化实验步骤

①由于诱导时间比较长，建议提前使用明胶包被6孔板。（注意此处是为了减少诱导过程细胞漂起、不贴壁）

②建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的MC3T3-E1细胞，将其消化下来，离心收集，使用MC3T3-E1细胞完全培养基调整细胞密度为1~5×105个cell/mL，均匀铺于6孔板中，每孔2mL，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。（注意：此处细胞密度及培养液体积以6孔板为例，若为其它培养器皿，请根据实际情况调整细胞密度及培养液体积。）

③待细胞汇合度达80%~时，即可进行诱导分化。

④小心吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入提前配制好的诱导分化完全培养基，每孔2mL，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。（注意：完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。）

⑤每2day换用新鲜的诱导分化完全培养基。由于细胞量比较大，培养液颜色会偏黄色属于正常现象，及时换液即可。（注意：完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。）

⑥细胞诱导3周后，即可进行茜素红染色鉴定。

⑦诱导过程中，已经成骨的MC3T3-E1细胞会变褐色和变圆。

3.鉴定方法

A.茜素红染色分析

① 细胞诱导分化结束后，小心吸弃细胞培养上清，1×PBS润洗1~2次。每孔加入1mL细胞固定液，室温固定15-30 min。（注意：操作一定要轻柔。）

② 吸弃细胞固定液，1×PBS润洗2次。沿孔壁缓慢加入茜素红染色液，每孔1mL，室温染色30min。（注意：染色液底部可能会有沉淀，吸取时尽量不要触及底部。若细胞染色后有沉淀，1×PBS洗去即可。）

③ 吸出染色液，1×PBS润洗，去掉浮色。显微镜下观察细胞染色效果，钙盐呈较深的橙红色。

④光镜拍照建议留一些pbs,减少光圈的出现，以便呈现更好的成骨效果。

B.成骨相关转录因子

矿化亚克隆选择性表达成骨细胞标志物、骨唾液蛋白 （BSP）、骨钙素 （OCN） 碱性磷酸酶（ALP） 骨桥蛋白（OPN）、I型胶原（COL I）和甲状旁腺激素 （PTH）/甲状旁腺激素相关蛋白 （PTHrP） 受体的 mRNA。相关引物序列如下

参考文献

标题：Inhibiting Osteolytic Breast Cancer Bone Metastasis by Bone-Targeted Nanoagent via Remodeling the Bone Tumor Microenvironment Combined with NIR-II Photothermal Therapy

作者：Yaoxun Zeng, Zhenxing Pan, Jiongpeng Yuan, Yuqiong Song, Zhenzhen Feng, Zefeng Chen, Zhaoyi Ye, Yushan Li, Ying Bao, Zhili Ran, Xinyi Li, Huiling Ye, Kun Zhang, Xujie Liu, Yan He

期刊：Small

DOI：First published: 21 May 2023 

影响因子 ：15.153

引用产品：ZQ0118，ZQ0095，ZQ0098

网址：https://doi.org/10.1002/smll.202301003

标题：Amino-Functionalized Zirconium-Based Metal–Organic Frameworks as Bifunctional Nanomaterials to Treat Bone Tumors and Promote Osteogenesis.(2023-11-09)

作者：Jongpeng Yuan,Xujie Liu

期刊：ACS Applied Materials & Interfaces

DOI: 10.1021/acsami.3c11787 

影响因子 ：9.5

引用产品：MC3T3-E1, MNNG/HOS and MDA-MB-231 cell

网址：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsami.3c11787

茜红素染色结果参考图

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